1.3 Механізми антикальциногенної дії MGP

 

 

Вивчення процесів кальцифікації у MGP-дефіцитних мишей показало, що для попередження мінералізації артеріальної стінки має значення походження MGP. Використовуючи методику введення гена MGP в гепатоцити, остеобласти і судинні ГМК за допомогою специфічних для цих клітин векторів, Murshed et al. [29] встановили, що відновлення синтезу MGP у печінці і, як результат, поява цього білка у достатній кількості в крові не мають жодного впливу на кальцифікацію артерій – вираженість її залишалася такою ж, як і в тотально MGP-дефіцитних мишей. Натомість, тільки відновлення експресії MGP у ГМК судин запобігало розвитку медіакальцинозу. MGP печінкового походження не мав впливу і на процеси мінералізації кісток: цей процес гальмувався тільки за умов відновлення синтезу MGP остеобластами. На підставі одержаних даних автори дійшли висновку, що антикальциногенна дія MGP in vivo не має системного характеру – вона залежить від місця утворення цього білка. Що стосується умов in vitro, то походження MGP не має значення для його інгібіторних ефектів. Так, утворений у печінці MGP пригнічував спонтанну кальцифікацію судинних ГМК у культурі клітин [17].

Описані вище спостереження свідчать про те, що циркулюючий MGP або (1) не захоплюється судинною стінкою, або (2) процес потрапляння MGP у кров та (чи) перенесення його кров’ю робить цей білок неактивним – можливо, через зв’язування його з іншими компонентами сироватки, або (3) активність MGP залежить від взаємодії з компонентами матриксу судинної стінки, що їх синтезують і вивільнюють ГМК [17]. Крім того, (4) MGP може діяти, і перебуваючи не в позаклітинному матриксі, а всередині судинних ГМК. На думку про це наводить той факт, що MGP виявлено всередині хондроцитів in vivo [30], а також у судинних ГМК людини, у яких посилену експресію  MGP індукували за допомогою аденовірусу [31]. При використанні MGP-специфічних антитіл значні кількості ендогенного MGP виявляли і всередині судинних ГМК в культурі клітин людини [17]. Оскільки Gla-залишки можуть зв’язувати іони кальцію, цілком імовірно, що MGP міг би відігравати важливу роль і в підтриманні внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу [17].

Антикальциногенні властивості MGP визначаються його Gla-залишками. Доказом цього є той факт, що декарбоксильваний MGP, у якому замість Gla міститься глютамінова кислота (Glu), втрачає свою активність. Про це свідчить і низка імуногістохімічних досліджень з використанням конформаційно специфічних антитіл до MGP [32,33,34]. Так, було показано, що в кальцифікованих судинах старих щурів  [34], так само як і в уражених артеріях щурів, що отримували варфарин з високими дозами вітаміну D [35], міститься погано карбоксильований (недокарбоксильований) MGP. Schurgers et al. [32], вивчаючи артерії людей, встановили, що в неуражених судинах MGP можна виявити тільки в карбоксильованій формі і навколо еластичних структур. Що стосується артерій з кальцифікованими атеросклеротичними бляшками і тих, що уражені артеріосклерозом Менкеберга, то MGP завжди був недокарбоксильованим і містився довкола осередків кальцифікації. На підставі цих даних було зроблено висновок, що порушення γ-карбоксилюваня MGP, так само як і пригнічення його синтезу, може бути одним з механізмів кальцифікації судин. Точні механізми, за допомогою яких MGP інгібує кальцифікацію судин, остаточно не з’ясовано. Сьогодні вивчаються чотири можливі механізми: (1) зв’язування з іонами кальцію і кристалами гідроксіапатиту; (2) зв’язування з компонентами позаклітинного матриксу; (3) взаємодія з кістковим морфогенетичним протеїном (BMP-2) і усунення ефектів останнього; (4) участь у регуляції апоптозу.

1. Зв’язування іонів кальцію та кристалів гідроксіапатиту. Одна з перших гіпотез щодо антикальциногенної дії MGP ґрунтувалася на здатності Gla-залишків зв’язуватися з іонами кальцію та утворювати разом із залишками аргініну комплекси з гідроксіапатитом [36] (рис. 2). Зв’язування надлишку іонів Ca2+ в м’яких тканинах має забезпечувати їх виведення з позаклітинного матриксу у кров [37], а зв’язування з малими кристалами інгібує дальший ріст останніх [27,38]. Така думка підтримується тим, що мРНК MGP виявляють у багатьох тканинах, але сам білок накопичується тільки в місцях кальцифікації і є в плазмі крові. Вважають, що зв’язування з іонами Ca2+ викликає конформаційні зміни в молекулах MGP та інших вітамін К-залежних білків, роблячи їх активними [17].

Рисунок.1.2 -  Утворення комплексів між бічними ланцюгами аргініну (Arg) та γ-карбоксиглютамінової кислоти (Gla) молекул MGP і поверхневими залишками фосфату та кальцієм кристалів гідроксіапатиту

Виявлено, що MGP є компонентом сироваткового комплексу, до складу якого входять також гідроксіапатит, фетуїн та інші білки [27]. Цей комплекс виявляли в крові щурів, що отримували один з препаратів бісфосфонатів - етидронат. У цьому ж дослідженні показано, що в контрольних тварин (у яких гідроксіапатитного комплексу нема) значна частина MGP циркулює як компонент сироватки з мол. масою > 300 кДа і тільки невелика кількість MGP входить до складу білкового комплексу з мол. масою < 300 кДа. Оскільки мол. маса самого MGP складає лише 10 кДа, це дає підстави думати, що основна частина MGP перебуває в крові або в агрегованій формі, або зв’язана з шаперонами більшої молекулярної маси.

Відносно мало досліджень проводилося з MGP як білком. Це пояснюється тим, що його чиста форма погано розчинна і він агрегує при нейтральних значеннях pH. MGP розчинний в фізіологічних буферах тільки в дуже низьких концентраціях [39]. Це може означати, що при накопиченні MGP його молекули зв’язуються одна з одною і більше не можуть вільно переміщуватися в тканині, аж поки не зійдуться з шапероном, який попереджає агрегацію/преципітацію MGP. На сьогодні механізми, які здійснюють транспорт MGP з клітин і тканин, а також фактори, які підтримують розчинність MGP, не відомі [17].

2. Зв’язування з компонентами позаклітинного матриксу. Еластин є одним з компонентів позаклітинного матриксу, з яким може зв’язуватися MGP. За допомогою імуногістологічних методів показано, що в нормальних артеріях людини молекули повністю карбоксильованого MGP містяться поблизу еластичних волокон [32]. Локалізація MGP в цих місцях може бути механізмом, що попереджає кальцифікацію, оскільки еластин є важливим субстратом для ініціювання утворення кальцієвих кристалів [40]. Еластичні волокна складаються з еластинового ядра, оточеного мікрофібрилами.  Порушення структури останніх може посилювати кальцифікацію. Основним білковим компонентом мікрофібрил є фібрилін-1, дефектний ген якого зумовлює появу продукту, характерного для синдрому Марфана [41]. У мишей, у яких зменшена експресія гена фібриліну-1, першою патологічною ознакою, що її виявляють, є медіакальциноз аорти [42]. Таким чином, фібрилін-1 має дуже важливе значення для запобігання кальцифікації середньої оболонки артерій. Розкриття точних механізмів взаємодії MGP з компонентами еластичних волокон без сумніву поліпшить наше розуміння того, як MGP виконує свої функції. Ще одним компонентом позаклітинного матриксу, з яким може зв’язуватися MGP, є глікопротеїн вітронектин [39]. На відміну від зв’язування MGP з BMP-2, взаємодія з вітронектином не є кальційзалежною, вона відбувається на рівні C-термінальної ділянки молекули MGP, а  тому не залежить від стану карбоксилювання MGP. Яке значення має зв’язування MGP з вітронектином у судинній стінці, ще не відомо, але є припущення, що така взаємодія може змінювати ефекти MGP щодо активності BMP-2.

3. Взаємодія з кістковим морфогенетичним протеїном (BMP-2). Цілий ряд фактів свідчить про те, що MGP має стосунок до процесів диференціювання судинних ГМК і цей вплив здійснюється через взаємодію з BMP-2. Так, (а) артерії, що зазнають кальцифікації в MGP-дефіцитних мишей, містять у медії подібні до хондроцитів клітини, а не типові судинні ГМК, і в них посилена експресія остеобласт-специфічного транскрипційного фактору cbfa1/Runx2 [43]; (б) показано, що MGP зв’язується з BMP-2 і пригнічує ефекти останнього на диференціювання мультипотентних мезенхімних клітин і стовбурових клітин червоного кісткового мозку [44,45]; (в) посилення експресії MGP в хондроцитах затримує їх дозрівання [46]; (г) у кальцифікованих судинах людини менше синтезується мРНК MGP, зате посилена експресія як хрящових, так і кісткових маркерів, таких як колаген II типу і остеокальцин відповідно [47,48].

З наведених спостережень випливає, що MGP є необхідним для судинних ГМК для того, щоб підтримувати їхній контрактильний фенотип і попереджати їх диференціювання у напрямі клітин, причетних до хондро/остеогенезу. За відсутності MGP ГМК судин втягуються в різні шляхи мезенхімного диференціювання і можуть перетворюватися в клітини, подібні до хондроцитів чи остеобластів, та продукувати матрикс, який сприяє відкладанню солей кальцію у вигляді кристалів гідроксіапатиту.

Дані про те, що MGP зв’язується з BMP-2 і припиняє його функціональні ефекти, значно розширюють наші уявлення про механізми функціонування MGP. BMP-2 є дуже важливим фактором  морфогенезу в кістках [49], але, крім того, він здатен індукувати експресію низки остеогенних генів в судинних ГМК [50]. BMP-2 знаходять у клітинах, що містяться в ділянках атеросклеротичних уражень [16], його експресія може бути індукована оксидативним стресом, запаленням і гіперглікемією [51,52,53]. Отже, слід думати, що антагонізм MGP по відношенню до BMP-2 має бути чинником, що попереджає чи зменшує остеогенні ефекти BMP-2 в судинній стінці. Сьогодні показано, що зв’язування MGP з BMP-2 залежить від іонів кальцію і в ньому бере участь Gla-домен молекули MGP [34,54]. Звідси випливає, що недокарбоксильовані форми MGP не можуть бути достатньо ефективними в інгібуванні ефектів BMP-2.

4. Участь у регуляції апоптозу. Апоптоз є важливим механізмом, що ініціює кальцифікацію судин [25,33]. Так, апоптоз передує кальцифікації багатоклітинних вузлів судинних ГМК у культурі клітин [25]. Апоптичні тільця, що утворюються із судинних ГМК, можуть відігравати роль центрів формування кальцієвих кристалів, їх виявляють як у місцях атеросклеротичних уражень, так і при Менкебергівському склерозі [55]. Вузли судинних ГМК in vitro містять відносно велику кількість клітин у стані апоптозу та апоптичних тілець. Експресія MGP є найбільшою, коли апоптичний індекс у цих вузлах сягає свого максимуму [25]. Це вказує на можливий зв’язок між MGP і апоптозом. Крім того, MGP було виявлено в апоптичних тільцях і матриксних везикулах, що утворюються судинними ГМК in vivo. Можливо, він присутній у цих везикулах для того, щоб обмежувати їхню здатність до кальцифікації [23]. Ряд інших досліджень дає підстави думати, що експресія MGP посилюється у відповідь на апоптоз. Так, утворення мРНК MGP збільшувалося, коли апоптоз індукували в клітинах гліоми чи у вентральних епітеліальних клітинах простати щурів [56,57]. У культивованих хондроцитах мишей посилена чи послаблена експресія MGP на чітко визначених стадіях дозрівання супроводжується апоптозом [58]. Крім того, добре відомо, що позаклітинний матрикс і його конститутивні білки впливають на виживання клітин [59]. Дані про те, що BMP-2 індукує апоптоз в судинних ГМК, а MGP є антагоністом BMP-2, добре узгоджуються з поглядами на MGP як важливого антиапоптичного фактора. Проте, відкритим залишається питання про те, чи дійсно високі  рівні експресії MGP конче необхідні для захисту судинних ГМК від апоптозу.