1.4 MGP і кальцифікація судинної стінки

 

 

Наявність Gla-вмісних білків у судинній стінці було вперше показано J.B.Lian et al. [60], які виділили амінокислоту Gla з лужних гідролізатів кальцифікованих атероматозних бляшок аорти людини. У гідролізатах неуражених судин і в не ускладнених кальцинозом атеросклеротичних бляшках Gla не виявляли, що дало підстави для висновку про тісний зв’язок між Gla-вмісними білками і процесами ектопічної кальцифікації.  R.L.Levy et al. [61] за допомогою EDTA-екстракції виділили з атеросклеротично змінених артерій білкову фракцію, що містить Gla. Низький рівень білків цієї фракції був характерний для жирових смужок і фіброзних бляшок, проте в кальцифікованих бляшках кількість їх була значною. Автори вважали, що вони відкрили унікальний Gla-білок, який назвали атерокальцином (мол.маса 80 кДа, 19 Gla-залишків на 1000 амінокислот). Проте згодом самі ж автори повідомили, що атерокальцин – це артефакт, зумовлений забрудненням препаратів судин білками сироватки крові [62].

Після відкриття MGP було доведено, що у стінках кровоносних судин Gla-вмісні білки представлено саме цим протеїном [63]. В артеріальній стінці MGP синтезується ГМК медії та інтими, а в місцях атеросклеротичних уражень і макрофагами [63]. За допомогою моноклональних антитіл було показано, що в стінці нормальних артерій людини MGP асоційований з ГМК та еластичними мембранами в медії і з позаклітинним матриксом в адвентиції [25].  Було встановлено, що MGP має стосунок до різних видів кальцифікації артеріальних судин.

MGP і атеросклероз. Кальцифікація атероматозних бляшок є одним з процесів, що завершує розвиток дегенеративних змін в інтимі [16,36,64]. Вивчення накопичення і експресії MGP в таких бляшках людини показало, що молекули цього білка мають тісний просторовий зв’язок з місцями відкладання гідроксіапатиту: їх виявляли на межі з осередками кальцифікації [24,63]. Проте, експресія гена MGP (утворення відповідної мРНК) в ГМК атероматозних бляшок була нижчою, якщо порівнювати з ГМК нормальних судин, які конститутивно експресують цей білок. Водночас у бляшках ГМК починали утворювати протеїни, що мають стосунок до процесів остео/хондрогенезу (остеокальцин, кістковий сіалопротеїн, лужну фосфатазу), і в нормі в артеріальній стінці не синтезуються. Ці спостереження дали підстави думати, що мінералізація структур судинної стінки може бути результатом порушення балансу між прокальциногенними (остео/хондрогенними) і антикальциногенними чинниками. До останніх було віднесено MGP [63].

MGP і артеріосклероз Менкеберга. Тісний просторовий зв’язок MGP з осередками кальцифікації було виявлено і при вивченні артерій ампутованих кінцівок у хворих на цукровий діабет. Відкладання солей кальцію у середню оболонку таких артерій (артеріосклероз Менкеберга) супроводжувалося, як і при атеросклерозі, зменшенням експресії гена MGP в ГМК судин [63]. На тлі таких змін ГМК починали експресувати остеогенні білки. При артеріосклерозі Менкеберга зникає тісний зв’язок MGP з еластичними мембранами в місцях кальцифікації судинної стінки, натомість і в людей і в щурів значну кількість MGP виявляли в позаклітинному матриксі медії на межі з осередками мінералізації [24].

MGP і кальцифікація ГМК судин in vitro. При культивуванні судинні ГМК втрачають ознаки свого контрактильного фенотипу і набувають рис модифікованих ГМК (міграція, проліферація, синтез компонентів сполучної тканини), характерних для ГМК атеросклеротичних бляшок. З часом судинні ГМК in vitro утворюють багатоклітинні вузли, які через 30 днів спонтанно кальцифікуються. З моменту появи перших ознак цього процесу в ГМК зростає експресія гена MGP і деяких остеогенних білків (остекальцину, кісткового сіалопротеїну) [63,65,66]. З другого боку, є дані про те, що при моделюванні кальцифікації судинних ГМК биків експресія MGP у цих клітинах, навпаки, зменшується [67]. Вона повертається до вихідного рівня, якщо процес мінералізації інгібувати за допомогою бісфосфонатів.

Таким чином, на підставі того, що експресія MGP в процесі кальцифікації може як зменшуватися, так і зростати, було зроблено припущення про два можливі варіанти розвитку подій. Перший з них полягає в тому, що чинники, які пригнічують експресію гена MGP, можуть сприяти розвитку мінералізації судинної стінки. Другий – у разі ініціювання кальцифікації іншими механізмами може посилюватися експресія адаптивних білків, які обмежують цей процес. До таких білків автори віднесли MGP [63].

Докази того, що MGP є важливим природним інгібітором кальцифікації in vivo було отримано в трьох групах досліджень, а саме (1) при вивченні генетично нокаутованих мишей (2) при експериментальному відтворенні варфаринової моделі уражень судин; (3) при виявленні причин синдрому Кейтеля у людей.

1. MGP-дефіцитні миші. Використовуючи методику генетичного нокауту, Luo et al. [68]  вивели лінію мишей, позбавлених гена MGP – MGP(-/-)-миші. Через два тижні після народження у таких тварин значно збільшувалася частота серцевих скорочень, вони відставали в рості, якщо порівнювати нормальними мишами відповідного віку. Протягом двох місяців від народження "генетично нокаутовані" миші помирали через кровотечі, спричинені розривом грудної або черевної аорти. При вивченні кровоносних судин (фарбування макропрепаратів алізарином червоним та гістологічних препаратів методом фон Косса) виявляли сильно виражену кальцифікацію аорти та її гілок. Відкладання солей кальцію відбувалося у всіх артеріях еластичного і м’язового типу, але не в артеріолах, капілярах чи венах. Перші ознаки кальцифікації артерій з’являлися через два тижні від народження тварин. Мінералізації перш за все зазнавали еластичні мембрани медії аортальної стінки. За цією ознакою ураження артерій у "генетично нокаутованих" мишей нагадували картину, характерну для артеріосклерозу Менкеберга у людей (медіакальциноз). Крім того, у таких тварин виявляли кальцифікацію вінцевих артерій серця та аортальних клапанів, але не міокарда. В уражених артеріях не було жодних проявів атеросклерозу: ні жирових смужок, ні атероматозних бляшок. У стінках судин можна було знайти клітини з властивостями хондроцитів. Вони продукували позаклітинний матрикс, за складом схожий до хрящової тканини (тип II колагену, протеоглікани). Поблизу таких хондроцитів виявляли матриксні везикули, з яких, як вважають, починається кальцифікація.

У MGP-дефіцитних мишей істотних змін зазнавав і скелет. Ненормальна кальцифікація хрящових пластинок росту в кістках вела до появи тріади ознак: (1) низького зросту; (2) остеопенії і (3) переломів кісток. Поєднані ураження артерій і скелету у таких мишей нагадували фенотип рідкої хвороби у людини – синдрому Синглетона-Мертена [69], що характеризується кальцифікацією артерій без атеросклерозу, низьким зростом, остеопенією кінцівок і смертю на першому десятилітті життя.

Пізніше було показано, що відновлення утворення MGP клітинами судинної стінки у MGP(-/-)-мишей попереджає кальцифікацію артерій [29]. У цих само дослідженнях (з використанням методики мутагенезу in vivo) встановлено, що антикальциногенна активність MGP залежить від 4-х з 5-ти Gla-залишків.

2. Варфаринова модель кальцифікації судин у щурів. Синтетичне похідне дикумаролу – варфарин – є антикоагулянтом непрямої дії.  Ще з 50-х років минулого століття цей препарат використовується в клініці як ефективний засіб запобігання тромбоутворенню. Антикоагулянтна дія варфарину ґрунтується на інгібуванні вітамін К-епоксидредуктази (VKOR) – ферменту, який перетворює окиснену форму вітаміну К у відновлену, після того як відбудеться карбоксилювання залишків глютамінової кислоти в молекулах протромбіну та інших факторів зсідання крові. Таким чином, під впливом варфарину зменшується пул відновленого вітаміну К, а отже, і утворення карбоксильованих, функціонально активних факторів коагуляції крові. Іншими словами, варфарин виступає антагоністом вітаміну К: його антикоагулянтну дію можна звести нанівець введенням ззовні препаратів відновленого вітаміну К [70].

Антагоністичні взаємовідносини між варфарином і вітаміном К мають свої особливості в печінці та позапечінкових органах і тканинах. З’ясувалося, що можна підібрати такі дози відновленого вітаміну К, які повністю припиняють антикоагулянтну дію варфарину, але не впливають на його ефекти в інших, ніж печінка, органах і тканинах, зокрема в кістках і стінках кровоносних судин [71]. Ця обставина дає змогу тривалий час вводити тваринам варфарин разом з вітаміном К, завдяки чому вдається запобігти спонтанних кровотеч при збереженні впливу варфарину на карбоксилювання білків, у тому числі MGP, у позапечінкових тканинах  [72].

Price et al. [19], використовуючи введення щурам високих доз варфарину разом з препаратами вітаміну К, показали, що за цих умов розвивається кальцифікація еластичних мембран в медії великих артерій і в тканинах аортальних клапанів. Перші ознаки кальцифікації аорти виявляли через 2 тижні від початку експерименту, а вже через 5 тижнів відкладання солей кальцію були настільки значними, що їх можна було бачити на рентгенівських знімках і просто оком. За всіма ознаками ураження судин, що їх спостерігали у "варфаринових" щурів, були дуже схожими на зміни артерій у MGP-дефіцитних мишей. Це дало підставу думати, що індукована варфарином кальцифікація є наслідком порушення γ-карбоксилювання MGP і вимиканням у такий спосіб його антикальциногенних функцій.

Порушення основної посттрансляційної модифікації MGP веде до того, що експресія гена MGP і рівень цього білка (некарбоксильованого) у кальцифікованих артеріях зростають [19]. Водночас зменшується концентрація MGP у сироватці крові.

Розвиток індукованих варфарином уражень артерій залежить від віку тварин. Ознаки медіакальцинозу аорти легко виникають у молодих 20-денних і 42-денних (у меншій мірі)  щурів, і зовсім не розвиваються у 10-місячних щурів [10]. При цьому має значення не сам вік тварин, а процес їх росту. Якщо уповільнити ріст щурів переведенням на раціон з недостатнім вмістом білків, то розвиток кальцифікації артерій уповільнюється.

Введення щурам варфарину разом з високими дозами вітаміну D веде до значного посилення кальциногенного ефекту кожного з цих чинників: кальцифікація артерій у таких тварин настає значно раніше і є більш вираженої, якщо порівнювати з дією варфарину і вітаміну D кожного окремо [10].

3. Синдром Кейтеля у людей. Рідкісна аутосомно-рецесивна хвороба – синдром Кейтеля – характеризується (а) ненормальною кальцифікацією хрящів; (б) периферичним стенозом легеневої артерії і (в) гіпоплазією середньої зони обличчя. У таких хворих розвивається виражена кальцифікація кровоносних судин. Встановлено, що хвороба пов’язана з хромосомою 12  – саме з тим її локусом, де знаходиться ген MGP (12p12.3-13.1) [34]. Три мутації гена MGP (С.69delG; IVS1-2A→G; С.113T→A) ведуть або до вкорочення молекули MGP, або до якісних її змін, унаслідок чого MGP втрачає свою функціональну активність. Виявлений зв’язок між такими дефектами MGP і розвитком кальцифікації судин може свідчити про те, що цей білок є важливим антикальциногенним фактором і в організмі людини.

 

 

 

 

 

 

 

Таблиця 1 - Зв’язок однонуклеотидних поліморфізмів гена MGP з  розвитком патологічних  процесів і хвороб людини