3. МЕТОДИКА ПРОВЕДЕННЯ ПОЛІМЕРАЗНОЇ ЛАНЦЮГОВОЇ РЕАКЦІЇ З НАСТУПНИМ АНАЛІЗОМ ДОВЖИНИ РЕСТРИКЦІЙНИХ ФРАГМЕНТІВ

 

 

Для генотипування венозну кров набирали в стерильних умовах в моновети об’ємом 2,7 мл з калієвою сіллю етилендіамінтетраоцтової кислоти ("Sarstedt", Німеччина), що слугувала антикоагулянтом. Кров заморожували і зберігали при температурі -20°С. ДНК з неї виділяли, використовуючи набори "Изоген" (Росія). Методом полімеразної ланцюгової реакції з наступним  аналізом  довжини  рестрикційних фрагментів визначали T-138→C поліморфізм промотора (rs1800802). Для цього ампліфікували ділянку промотора вказаного гена за допомогою пари специфічних праймерів: прямого (sence) – 5`-AAGCATACGАТGGCCAAAACTTCTGCA-3` і зворотного (antisense) – 5`-GAACTAGCAТТGGAACTTTTCCCAACC-3`. Праймери було синтезовано фірмою “Metabion” (Німеччина).  Для ампліфікації брали 50-100 нг ДНК і додавали до суміші, що містила 5 мкл 5-кратного PCR-буферу, 1,5 мМ сульфату магнію, 200 мкМ суміші чотирьох нуклеотидтрифосфатів, по 20 pM кожного з праймерів і 0,5 ОД Taq-полімерази (“Ферментас”, Литва), об’єм доводили до 25 мкл деіонізованою водою. PCR проводили в термоциклері GeneAmp PCR System 2700 ("Applied Biosystems", США). Ампліфікація фрагмента промотора складалася з 33 циклів: денатурація – 94°С (30 с), гібридизація праймерів – 57°С (1 хв) і елонгація – 72°С (1 хв). Пізніше 6 мкл продукту ампліфікації фрагмента промотора інкубували при 37°С протягом 18 годин з 3 ОД рестриктази BseNI  ("Ферментас", Литва) у буфері B такого складу: 10 мМ трис-HCl (pH 7,5), 10 мМ хлориду магнію і 0,1 мг/мл альбуміну. Якщо в -138  позиції гена MGP містився тимін, ампліфікат, який складався з 142 пар основ, розщеплювався рестриктазою BseNI  на два фрагменти – 118 і 24 пари основ. У разі заміни тиміну на цитозин сайт рестрикції для BseNI втрачався і утворювався один фрагмент розміром 142 пари основ (рис. 3.1А

Алельний поліморфізм промотора гена MGP G-7→A (rs1800801) визначали також шляхом ампліфікації фрагмента і наступної рестрикції. Послідовність нуклеотидів у специфічних праймерах була такою: прямий (sence) – 5`-CTAG  TTCAGTGCCAACCCTTCCCCACC-3`, зворотний (antisense) – 5`-TAGCAGCA GTAGGGAGAGAGGCTCCCA-3`. Для ампліфікації брали 50-100 нг ДНК і додавали до суміші, що містила 5 мкл 5-кратного PCR-буферу, 1,5 мМ сульфату магнію, 200 мкМ суміші чотирьох нуклеотидтрифосфатів, по 20 pM кожного з праймерів і 0,75 ОД Taq-полімерази ("Ферментас", Литва ), об’єм доводили до 25 мкл деіонізованою водою. Ампліфікація фрагмента, що містив стартову ділянку, складалася з 33 циклів: денатурація – 94°С (50c), гібридизація праймерів – 64,5°С (45 с) і елонгація – 72°С (1 хв). Для рестрикційного аналізу 6 мкл продукту ампліфікації інкубували при 37°С протягом 18 годин з 2 ОД рестриктази  NcoI  у буфері Тango такого складу: 33 мМ трис-ацетату (рН 7.9), 10 мМ ацетату магнію, 66 мМ ацетату калiю, 0,1 мг/мл альбуміну. Якщо в -7 позиції гена MGP містився гуанін, ампліфікат, який складався з 500 пар основ, розщеплювався рестриктазою NcoI  на два фрагменти – 240 і 260 пар основ. У разі заміни гуаніну на аденін сайт рестрикції для NcoI втрачався і візуалізувався один фрагмент завдовжки 500 пар основ (рис. 3.1Б).

Ампліфікати обох вивчених фрагментів гена MGP після рестрикції розділяли в 2,5% агарозному гелі, що містив бромистий етидій. Горизонтальний електрофорез (0,1А; 140V) проводили протягом  25 хв (T-138→C), 40 хв (G-7→A). Візуалізацію ДНК після електрофорезу здійснювали за допомогою трансілюмінатора ("Біоком", Росія).

Одержані результати опрацьовували статистично з використанням пакета SPSS 17.0. При цьому достовірність відмінностей визначали за χ2-критерієм. Значення P < 0,05 вважали достовірним.