1. Матеріали і методи дослідження.

З метою вивчення впливу комбінації солей важких металів і випромінення проведений експеримент на 370 безпородних щурах-самцях трьох вікових груп: молодих, зрілих та старечого віку, що утримувались у віварії Медичного інститута СумДУ. Вибір щурів як біологічної моделі обумовлений рядом спільних особливостей будови та функції різних органів і систем тварин і людини.

Перед початком експерименту  тварин оглядали, враховуючи їх локомоторну активність та стан шкірного покриву. Після вибракування щурів з аномаліями поведінки, тварин вводили в експеримент.  Утримання тварин та  експерименти проводилися  відповідно до положень «Європейської конвенції про захист хребетних  тварин, які використовуються для експериментів та інших наукових цілей» (Страсбург, 1985), «Загальних етичних принципів експериментів на тваринах»,  ухвалених Першим національним конгресом з біоетики (Київ, 2001), Хельсинської декларації Генеральної асамблеї Всесвітньої медичної асоціації (2000). Комісією з питань біоетики  Медичного інститута Сумського державного університету (протокол № 1 від 10 березня 2008 р.) порушень морально-етичних норм при проведенні науково-дослідницької роботи не виявлено.

Залежно від віку та впливу комбінацій важких металів усі тварини були поділені на 5 серій.

I серія  – яким моделювали екологічну ситуацію Ямпільського району Сумської області, для якої притаманне збільшення вмісту міді, цинку та заліза у водоймах та грунтах, а саме: солей цинку (ZnSO4) – 50  мг/л, міді (CuSО4) – 20,0 мг/л та заліза (FeSO4) – 20 мг/л. Для вивчення вікових особливостей дії мікроелементозів на організм тварин експеримент проводився в межах 3 вікових груп (по 18 особин в кожній): молоді тварини (4-6 місяців), зрілого віку (7-9 місяців) та щурі старечого віку (20-22 місяця). Кожна група тварин отримувала солі важких металів протягом 1, 2 та 3 місяців, що дозволило простежити  підгостру дію екзотоксикантів, а також опромінювалися в дозі 0,1, 0,2 і 0,3 Гр.

II серія  – тварини трьох вікових груп, яким моделювались екологічні умови Шосткинського району, – протягом 1, 2 та 3 місяців з питною водою додавали  солі  цинку (ZnSO4) – 50  мг/л, хрому (K2Cr2O7) – 10,0 мг/л і свинцю (Pb(NO3)2) – 3 мг/л і опромінюнення в дозі 0,1, 0,2 і 0,3 Гр.

III серія – тварини трьох вікових груп, яким моделювались екологічні умови Середино-Будського району, – протягом 1, 2 та 3 місяців з питною водою додавали  солі марганцю (MnSO4 x 5H2O) - 5,0  мг/л, свинцю (Pb(NO3)2) - 3 мг/л та міді (CuSO4 )– 20,0 мг/л і опромінюнення в дозі 0,1, 0,2 і 0,3 Гр.

ІV серія - контрольна, до якої увійшли інтактні щурі всіх вікових груп, що дозволило провести коректний порівняльний аналіз з експериментальними серіями тварин.

           Група експериментальних та контрольних тварин забивалася під ефірним наркозом шляхом декапітації на наступний день після закінчення експерименту. На дослідження забиралися серця щурів.

           Для дослідження серця використовувалися такі методики:

            1. Морфометричні виміри відділів і камер серця. Серце розтинали за методикою Г.Г. Автанділова (1990), розділяючи його на 4 частини: лівий та правий шлуночки, міжшлуночкову перегородку та передсердя. Окремо зважували частини серця за W. Muller з урахуванням модифікації R.M. Fulton et al., Г.І. Ільїна (38), використовували непряму планіметрію ендокардіальних поверхонь шлуночків серця.

            2. Гістологічне дослідження міокарда шлуночків. Вирізалися шматочки міокарда з передніх і бічних стінок лівого та правого шлуночків, міжшлуночкової перегородки. Препарати фіксували в 10 % розчині нейтрального формаліну, після відповідної проводки заливали в парафін. Готували гістологічні зрізи товщиною 10 -15 мкм та забарвлювали їх гематоксилін-еозином, за ван-Гізон та залізним гематоксиліном Гейденгайна. 

3. Морфометрія гістологічних препаратів. За допомогою гістоморфометрії визначали діаметр  кардіоміоцитів шлуночків (ДКМЛШ і ДКМПШ ), діаметр ядер кардіоміоцитів лівого та правого шлуночків (ДЯКМЛШ і ДЯКМПШ), відносний об'єм кардіоміоцитів лівого та правого шлуночків (ВОКМЛШ і ВОКМПШ), відносний об'єм судин у шлуночках (ВОСЛШ і ВОСПШ),  відносний об'єм сполучної тканини в лівому та правому шлуночках (ВОСТЛШ і ВОСТПШ), стромально-кардіоміоцитарне відношення в шлуночках (СТКМВЛШ, СТКМВПШ). Відносні об’єми кардіоміоцитів, судин, сполучної тканини визначалися методом «точкового» підрахунку (Г.Г. Автандилов, 1990; В.Д. Мішалов, 1994), СТКМВ вираховувалося за формулою (ВОСТ+ВОС)/ВОКМ, інші показники – за допомогою комп’ютерної програми «Видео Размер 5,0».

4. Вивчення хімічного складу серця. На атомному абсорбційному спектрофотометрі С-115М1 за загальноприйнятою методикою визначали кількість цинку (довжина хвилі - 213,9 нм), міді (довжина хвилі - 324,7 нм), свинцю (довжина хвилі - 283,3 нм), марганцю (довжина хвилі - 279,5 нм), хрому (довжина хвилі - 357,9 нм), заліза (довжина хвилі - 248,3  нм), кальцію (довжина хвилі - 271,5 нм), магнію (довжина хвилі - 328,4 нм). Концентрацію натрію та калію визначали методом емісії.

Для гістологічних досліджень нирки одразу після її видалення і зважування  вирізали шматочки товщиною 5 мм. Матеріал фіксували протягом 2-3 тижнів в 10% розчині нейтрального формаліну з трьохразовою зміною фіксатора, потім зневоднювали в спиртах зростаючої концентрації, після чого заливали у парафінові блоки. Зрізи, товщиною 5-6 мкм, забарвлені гематоксилин-еозином, досліджували у світлооптичному мікроскопі “Olimpus” і документували за допомогою цифрової мікровідеокамери.

Для електронномікроскопічного дослідження з середньої частини кіркової речовини нирки вирізали маленькі шматочки тканини. Матеріал фіксували у 2,5 % розчині глютаральдегіду з активною реакцією середовища Ph 7,3-7,4 приготовленому на фосфатному буфері Міллоніга. Фіксований матеріал через 50-60 хвилин переносили у буферний розчин і промивали протягом 20-30 хвилин. Постфіксацію матеріалу здійснювали 1% розчином чотириокису осмію на буфері Міллоніга протягом 60 хвилин, після чого проводили його дегідратацію в спиртах і ацетоні та заливали в суміш епоксидних смол. Ультратонкі зрізи, виготовлені на ультрамікротомі, забарвлювали 1% розчином уранілацетату, контрастували згідно методу Рейнольдса та вивчали в електронному мікроскопі ПЭМ – 100К.

Для дослідження печінки використовувалися наступні методики:

1. Визначення відносної маси печінки за формулою:

 ,

де Мвідн. – відносна маса печінки, Mп – маса печінки даного щура, Мт – маса тіла даного щура.

2. Лінійні розміри печінки (довжина, ширина, товщина) визначали за допомогою штангенциркуля з точністю до 0,1 мм.

3. Гістологічне дослідження. Печінку фіксували в 10% розчині нейтрального формаліну, промивали проточною водою, дегідратували в спиртах зростаючої концентрації та занурювали у парафін. На санному мікротомі виготовлялися зрізи товщиною 5-7 мкм. Препарати забарвлювали гематоксилін – еозином.

4. Морфометрію гістопрепаратів печінки проводили за допомогою світлового мікроскопа „Олімпус” з цифровою відеокамерою та пакетом прикладних програм „Видео Тест 5,0” та „Видео размер 5,0”. Зображення зберігали на вінчестері з наступним друком кольорових ілюстрацій.

5. Електронно-мікроскопічне дослідження. Тканину печінки розміром 1 мм2 занурювали в 1% забуферений розчин чотириокису осмію при температурі 40С. Після фіксації тканину промивали у буферному розчині і проводили дегідратацію в спиртах зростаючої концентрації та ацетоні. Потім її укладали в суміш епоксидних смол за загальноприйнятою методикою. Ультратонкі зрізи одержували на ультрамікротомі УМПТ-6, контрастували цитратом свинцю і переглядали на електронному мікроскопі ЕВМ-100 БР гепатоцити і ретикулоендотеліоцити.

6. Визначення хімічного складу. Зважену печінку від даної групи закривали у сушильній шафі при температурі 1050С і висушували до постійної ваги. За різницю у вазі вологої і сухої печінки визначали кількість води. Потім висушену тканину спалювали в порцелянових тиглях у муфельній печі при температурі 4500С протягом 48 годин. Шляхом зважування золи вираховувалася загальна кількість мінеральних речовин, а за різницею у вазі сухої печінки і попелу – кількість органічних речовин. Отриманий попіл розчиняли в 10% соляній кислоті і доводили бідистильованою водою до визначеного об’єму. На атомному абсорбційному спектрофотометрі С-115М1 за загальноприйнятою методикою визначали кількість міді (довжина хвилі – 324,7 нм), цинку (довжина хвилі – 213,9 нм), хрому (довжина хвилі – 357,9 нм), свинцю (довжина хвилі – 287,3 нм) і марганцю (довжина хвилі – 279,5 нм).

Для дослідження кісток використовували наступні методики:

Кістки зважували на аналітичних вагах з точністю до 1 мг та вимірювали штангенциркулем по методиці  W. Duerst  з точністю до 0,1 мм. Остеометрія для довгих трубчастих кісток включала в себе наступні показники: найбільша довжина кістки, найбільша ширина проксимального та дистального епіфізів, найбільша ширина та передньо-задній розмір середини діафізу.

Гістологічне дослідження діафізу та епіфізарного хряща. Досліджувалися дистальні епіфізарні хрящі плечової і стегнової кісток і проксимальний - великогомілкової, за рахунок яких іде найбільший ріст кістки в довжину [39, 40]. Для цього брали ділянки кісток із епіфізів та середини діафізу, фіксували в 10% розчині нейтрального формаліну, проводили декальцинацію в розчині Трилону Б на протязі двох місяців, зневоднювали в спиртах зростаючої концентрації та заливали в целлоідин та парафін. Готували гістологічні зрізи товщиною 10-12 мкм та забарвлювали їх гематоксилін-еозином та за Ван-Гізоном.

Морфометрія діафізу проводилася за наступними параметрами: ширина зон зовнішніх та  внутрішніх генеральних пластинок, ширина остеонного шару, діаметр остеонів та їх каналів. В епіфізарному хрящі вимірювали загальну ширину зони росту та ширину зон індиферентного, проліферуючого, дефінітивного хряща та зони деструкції. Морфометрію проводили за допомогою світового мікроскопа "Олімпус" з цифровою відеокамерою та пакетом прикладних програм "Видео Тест 5,0" та "Видео размер 5,0". Зображення зберігали на вінчестері з наступним друком кольорових ілюстрацій.

Визначення хімічного складу. Зважену  кістку від даної групи закривали в сушильній шафі при температурі 105ОС і висушували до постійної ваги. За різницею у вазі вологої і сухої кістки визначали її вологість. Потім висушену тканину спалювали в порцелянових тиглях у муфельній печі при температурі 450ОС протягом 48 годин. Шляхом зважування попелу вираховувалася загальна кількість мінеральних речовин на сухий залишок. Отриманий попіл розчиняли в 10% соляній та азотній кислотах і доводили бідистильованою водою до 25 мл. На атомному абсорбційному спектрофотометрі С-115М1 за загальноприйнятою методикою визначали кількість кальцію (довжина хвилі - 422,7 нм), калію (довжина хвилі - 404,4 нм), натрію (довжина хвилі - 330,3 нм), магнію (довжина хвилі - 285,2 нм), міді (довжина хвилі - 324,7 нм), цинку (довжина хвилі - 213,9 нм), свинцю (довжина хвилі - 287,3 нм) і марганцю (довжина хвилі - 279,5 нм).

Отримані дані обробляли статистично на персональному комп'ютері із використанням пакета прикладних програм. Достовірність розходження експериментальних і контрольних даних оцінювали з використанням критерію Ст'юдента, достатньою вважали ймовірність помилки менше 5% (р<0,05).